2018-08-01
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為抵御各種各樣的病原體，人類或哺乳動物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)擁有大量的T細(xì)胞受體(TCRs)和B細(xì)胞受體(BCRs)，統(tǒng)稱為免疫組庫。高通量測序（NGS）技術(shù)允許對T或B細(xì)胞克隆進(jìn)行深入分析，能夠在檢測T或B細(xì)胞時提供前所未有的精細(xì)度。
該技術(shù)可以有效評估TCR或BCR互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR3)的多樣性，并評估克隆類型的構(gòu)成：包括特定克隆類型的比例；克隆之間的相似程度；V(D)J基因的使用頻率；核苷酸插入與缺失；CDR3區(qū)域長度分布等信息。因此，免疫組庫高通量測序?yàn)樵u估健康或疾病狀態(tài)下的機(jī)體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)提供了可能。
高通量測序技術(shù)可快速便捷地對免疫組庫進(jìn)行全景式的掃描，但其涉及的PCR反應(yīng)會導(dǎo)致假陽性增加以及擴(kuò)增偏倚，從而對數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成潛在影響。
目前，現(xiàn)有的免疫組庫技術(shù)主要分為兩類：
1.基于多重PCR的文庫構(gòu)建方案：以DNA為模板，針對可變區(qū)（CDR3）設(shè)計(jì)多對引物，擴(kuò)增出CDR3區(qū)段，再進(jìn)行文庫構(gòu)建并測序；
2.基于5'RACE的文庫構(gòu)建方案：以mRNA為模板，在恒定區(qū)設(shè)計(jì)引物逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)出TCR或BCR的全長序列，經(jīng)過兩輪PCR富集這一目的序列，再進(jìn)行文庫構(gòu)建并測序。
但是，現(xiàn)有的基于多重PCR的文庫構(gòu)建方案存在明顯不足之處：該方法同時進(jìn)行幾十種引物的擴(kuò)增，體系異常復(fù)雜；多重引物設(shè)計(jì)需已知參考序列，不能充分捕捉到人類等位基因突變序列；多種引物擴(kuò)增效率可能存在偏倚，難以等效擴(kuò)增；與使用mRNA構(gòu)建文庫相比，DNA所需的PCR反應(yīng)體系較大，樣本要求較高。
技術(shù)升級一：
廣州華銀健康科技有限公司推出全新的免疫組庫測序技術(shù)服務(wù)，基于5'RACE原理，并在原始模板擴(kuò)增前引入U(xiǎn)MI（Unique Molecular Indices，分子條形碼）進(jìn)行文庫構(gòu)建：以恒定區(qū)單引物逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出CDR區(qū)
域全長序列的同時，引入U(xiǎn)MI序列，可對后續(xù)PCR反應(yīng)或測序過程中引入的錯誤進(jìn)行有效糾正，從而提高準(zhǔn)確率。
技術(shù)升級二：
在逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，廣州華銀健康科技有限公司設(shè)計(jì)了針對微量樣品（低至100個細(xì)胞）的實(shí)驗(yàn)流程：即通過oligo dT磁珠捕獲mRNA，以磁珠上的oligo dT為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，并純化回收cDNA，較常規(guī)方法可大大提高效率，保證了人或小鼠來源的微量樣品的實(shí)驗(yàn)成功率。
全新免疫組庫測序技術(shù)服務(wù)亮點(diǎn)
1.可滿足微量樣品建庫的實(shí)驗(yàn)要求（最低可至100個細(xì)胞），兼容人以及小鼠樣本
微量RNA起始建庫流程圖
2.低RNA起始量的樣本也能快速達(dá)到測序飽和期，相同RNA起始量下的樣本其相關(guān)度較高
同一樣本RNA起始量不同時到達(dá)測序飽和期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)曲線圖
同一樣本RNA起始量相同時樣本間的相關(guān)性圖
（A1/A2/A3為起始RNA量為1600ng; B1/B2/B3為起始量為400ng; C1/C2/C3為起始量為50ng）
3.基于強(qiáng)大的UMI標(biāo)記與校正算法，可有效糾正PCR與測序過程引入的錯誤與偏倚，極大地提高準(zhǔn)確度
經(jīng)過UMI算法校正后的部分測試數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表
4.對測序下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行多維度分析，給出最全面的數(shù)據(jù)結(jié)果報(bào)告，并可定制個性化分析服務(wù)
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